大豆多肽屬于生物活性肽，是以大豆蛋白為主要原料，經(jīng)過(guò)提取分離、純化并精制而成的低聚肽的混合物(蛋白質(zhì)水解物)，通常以由 3～6個(gè)氨基酸組成的小分子肽為主，還含有少量游離氨基酸、糖類(lèi)、水分和無(wú)機鹽等。大豆多肽具有較高的營(yíng)養價(jià)值，其氨基酸組成與大豆蛋白完全一樣，是一種理想的新型大豆深加工產(chǎn)品【1】。
大豆蛋白經(jīng)酶水解后，其產(chǎn)物中含有多種生理活性肽小分子大豆肽不僅溶解性好、黏度低，而且在人體內消化吸收快。另外，還具有降血壓、降血脂、降膽固醇、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、脂肪代謝、免疫調節、抗氧化、抗癌、抗輻射、減肥、調節血糖濃度、抗疲勞、低過(guò)敏性、促進(jìn)微生物的生長(cháng)發(fā)育和代謝等多種不同的生物活性【2】。
大豆蛋白酶水解產(chǎn)物在食品工業(yè)中一般應用于飲料、奶粉奶酪乳制品和代乳品中，也可添加在肉類(lèi)食品和醋、醬油等發(fā)酵食品中，可以用來(lái)生產(chǎn)面條、饅頭、面包以及冷凍食品. 以顯著(zhù)提高產(chǎn)品的品質(zhì)和營(yíng)養價(jià)值，并增強產(chǎn)品的口感風(fēng)味【1】【2】。
《GB/T 22492-2008 大豆肽粉》為生產(chǎn)企業(yè)提供一個(gè)通用的產(chǎn)品質(zhì)量規范，但對于大豆肽粉在大豆蛋白提取、酶解、發(fā)酵、肽的過(guò)膜分離(超濾、微濾、納濾)、色譜分離(液相、GPC)、脫色、脫苦等工藝控制環(huán)節沒(méi)有指導方法。
本文探索了豆粕蛋白酶解粗肽的反相液相色譜分析方法，操作簡(jiǎn)便，通用性好，適用于質(zhì)控環(huán)節，為液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測序提供了先導方法。
2、樣品前處理
2.1 試劑配制
流動(dòng)相：取3mL色譜級甲酸加入1L色譜級乙腈中，無(wú)需抽濾，混勻超聲10min；取3mL色譜級甲酸加入1L超純水中，無(wú)需抽濾，混勻超聲10min。
2.2 試劑配制
樣品配制：樣品為豆粕蛋白的酶解產(chǎn)物，未經(jīng)過(guò)膜處理，多肽分子量分布很廣的粗品。分別稱(chēng)取大豆肽1號2號3號試樣各20mg于三個(gè)2ml液相小瓶中，各加超純水1ml，渦旋1min，用0.22um尼龍66濾頭過(guò)濾，待用。
3、色譜條件
3.1 儀器信息
儀器硬件：ThermoFisher Vanquish液相色譜儀
色譜軟件：變色龍Chromeleon 7.3.1；中藥指紋圖譜相似度評價(jià)軟件
3.2 方法信息
色譜柱：Accucore Vanquish C18 2.1 mm×150 mm，1.5 μm(PN：27101-152130)
流動(dòng)相：A：0.3%甲酸水溶液；B：0.3%甲酸乙腈溶液，
流速：0.2 mL/min，梯度程序見(jiàn)表1：
表1. 梯度洗脫程序
進(jìn)樣量：2 µL
柱溫：30℃(still air模式)
檢測器波長(cháng)：280nm
4、樣品分析譜圖及測定結果
4.1 典型色譜圖
圖1a. 大豆肽1號樣品和空白色譜圖疊圖
圖1b. 大豆肽1號224nm、280nm色譜圖及光譜信息
4.2 重復性
圖2. 大豆肽3號樣品六針連續進(jìn)樣色譜、壓力疊圖
表2. 大豆肽3號樣品六針連續進(jìn)樣保留時(shí)間和峰面積穩定性數據
4.3 相似度評價(jià)
借助中藥指紋圖譜相似度評價(jià)軟件，可以比較兩個(gè)譜圖之間的差異，進(jìn)而了解來(lái)料大豆肽的批次間差異，為指導工藝調整提供科學(xué)直觀(guān)依據。
圖3. 大豆肽1號、2號、3號指紋圖譜和相似度評價(jià)結果
● 積分參數平滑為0.4，即加大平滑令色譜峰以峰組形式存在，數目相對減少時(shí)，以大豆肽3號為對照時(shí)，大豆肽1號的相似度為0.663，大豆肽2號的相似度為0.7。
● 針對復雜樣品，以峰組形式積分(結合平滑等參數)，可以得到數目合適，又能覆蓋主要色譜峰的積分譜圖?；诖说脑u價(jià)結果才更為合理。
結果與討論
1、客戶(hù)樣品為豆粕蛋白酶解產(chǎn)物，未經(jīng)過(guò)膜分離，多肽分子量分布跨度大，同時(shí)不排除混有糖、蛋白、氨基酸等其他化合物。若能將樣品通過(guò)超濾膜分離凈化，按照分子量范圍分成幾組肽段，分別建立液相方法，則借助液相做質(zhì)控更科學(xué)嚴謹一些。
2、樣品前處理少，優(yōu)勢在于快捷高效，成本低，適于工廠(chǎng)化驗室操作，對人員要求不高。劣勢在于樣品基質(zhì)復雜、粗肽組份繁雜，對液相的穩定性要求非常高。峰組ABCD的保留時(shí)間穩定性在1%以?xún)?、峰面積重現性在2%以?xún)?。每組六針進(jìn)樣壓力曲線(xiàn)都非常平穩波動(dòng)僅在0.4 bar，該方法穩定性非常好。
3、創(chuàng )造性的首次將粗肽分析與中藥指紋圖譜相似度評價(jià)軟件相結合，可以從整體分析、在宏觀(guān)上了解粗肽批次間的差異；憑借Vanquish液相卓越的穩定性，在變色龍軟件里平行比較兩批次樣品譜圖的細節差異。進(jìn)而從宏觀(guān)和微觀(guān)兩方面入手，在調控酶解、過(guò)膜超濾、GPC分離等工藝環(huán)節中發(fā)揮指導作用。解決粗肽可視化直觀(guān)化的質(zhì)控問(wèn)題。
4、做相似度評價(jià)時(shí)，建議選取成熟穩定粗肽樣品中主要成分色譜峰或峰組作為評價(jià)標的。積分時(shí)通過(guò)加大平滑將色譜峰以峰組的形式積分，即簡(jiǎn)化譜圖，又可提升譜圖間可比性。通常相似度0.9以上認為批次間是穩定一致的。解決粗肽質(zhì)控評價(jià)標準的建立問(wèn)題。
5、從向食品中添加大豆肽，以提升食品(代乳制品、醬油、面食等)營(yíng)養和品質(zhì)角度來(lái)說(shuō)，本法做來(lái)料質(zhì)控基本可行。從向食品中添加活性肽，打造功能性保健食品角度來(lái)說(shuō)，還需進(jìn)一步對來(lái)料做超濾膜分離，得到5000Da以下的肽，本法為MS友好流動(dòng)相可以直接結合高分辨質(zhì)譜找到有價(jià)值的活性肽。從科研角度來(lái)說(shuō)，本法基礎上擴展CAD電霧式檢測器，可以檢測無(wú)紫外吸收和弱紫外吸收的物質(zhì)，如氨基酸、GABA(伽馬氨基丁酸)、單糖多糖等。
6、客戶(hù)要求用Accucore 1.5 μm的色譜柱開(kāi)發(fā)該方法，以期面對極其復雜樣品時(shí)，能得到較好分離度，考慮到樣品和基質(zhì)實(shí)際情況，推薦客戶(hù)試用Hypersil GOLD Peptide 1.9um，175Å色譜柱兩根串聯(lián)使用提高復雜樣品分離能力，賽默飛還有其他適合分析多肽的色譜柱，如Accucore 150 C4，Acclaim 300 C18，BioBasic 300Å等。
7、該方法操作簡(jiǎn)單僅需過(guò)濾樣品即可，是降本又增效的液相色譜分析方案，將會(huì )對食品工業(yè)中添加粗肽、大豆肽的企業(yè)提高品控水平。
8、本文為探索性質(zhì)的實(shí)驗。為解決粗肽、大豆肽生產(chǎn)過(guò)程中部分質(zhì)控問(wèn)題，提出跨界解決問(wèn)題的思路，若能結合GPC做分子量分布研究，將其整合為一套完整方案，則產(chǎn)品質(zhì)控會(huì )更加全面嚴謹，終將有利于生成企業(yè)、消費者和監管部門(mén)。
合作伙伴
李丹課題組：李丹，男，生于1972年10月；江南大學(xué)食品科學(xué)博士、韓國國立首爾大學(xué) (Seoul National University) 食品科學(xué)與生物技術(shù)系博士后、美國佛羅里達大學(xué) (University of Florida) 微生物與細胞科學(xué)系訪(fǎng)問(wèn)學(xué)者；教育部新世紀優(yōu)秀人才；吉林省二級教授，吉林省有突出貢獻的中青年專(zhuān)業(yè)技術(shù)人才，吉林省拔尖創(chuàng )新人才二層次?，F任長(cháng)春大學(xué)“大豆生物加工技術(shù)吉林省發(fā)改委工程實(shí)驗室”主任、“農產(chǎn)品加工吉林省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗室”主任。主要從事食品科學(xué)與農產(chǎn)品加工技術(shù)領(lǐng)域的教學(xué)與科研工作。主持完成國家自然科學(xué)基金“面上項目”2項，主持完成科技部“國際科技合作項目”1項，主持完成“教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”和“教育部留學(xué)回國人員科研基金”項目2項，主持完成省市廳級科技計劃項目11項；在本學(xué)科國際著(zhù)名SCI期刊，發(fā)表英文論文50余篇，其中在中科院學(xué)術(shù)期刊分區一區期刊發(fā)表論文18篇；獲得授權發(fā)明專(zhuān)利6件，獲得英國Elsevier最多引用論文獎、吉林省科技廳吉林省科技獎自然科學(xué)獎二等獎等省部級科研成果獎勵9項。
參考文獻：
【1】大豆多肽的研究進(jìn)展 高蕾蕾，李迎秋2018 年第 2 期 江蘇調味副食品 總第 153 期 *? DOI: 10. 16782 /j. cnki. 32-1235 /ts. 2018. 02. 002
【2】大豆蛋白酶水解產(chǎn)物對面粉糊化特性的影響崔會(huì )娟，王璐，郭興鳳 *河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版) Journal of Henan University of Technology(Natural Science Edition) 第 36 卷第 1 期 2015 年 2 月
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